Development of Clostridium cochlearium by UV-Mutation technique and the construction of a prototype bioreactor with conditions control system via the internet of things for biobutanol production.

Abstract

This research intended to develop Clostridium cochlearium to increase butanol producibility and to design to build a bioreactor controlled by the Internet of Things (IoT) system which is specific to biobutanol production. The C. cochlearium was mutated by using UV irradiation in exposure time of 0, 15, 30, 45, 60, 75, and 90 sec., respectively. It was found that at 45 and 60 sec of UV exposure had the largest among of survival colonies., The 96 isolates of mutant were tested for butanol tolerance. The highest concentration of butanol that mutant can survive was at 2.8 %v/v and 6 isolates were selected, namely 45-20, 45-21, 60-12, 60-16, 60-17, and 60-25. Mutants and wild type were tested for the production of organic solvents including, acetone, butanol, and ethanol by GC-MS. It found that isolate 45-20 showed the highest butanol production, followed by 45-21, 60-16, 60-12, 60-17, wild type and 60-25 which were able to produce butanol at the concentrations of 1.7302, 1.0263, 0.8116, 0.7233, 0.5986, 0.1085 and 0.0081 g/L respectively, The highest concentrations of ethanol was also produced by isolate 45-20 at the concentration of 1.5197 g/L, While the highest concentrations of acetone was produced by the wild type at the concentration of 0.3852 g/L. The specific growth rate at 6 isolates was determined, it showed that the 60-12 has the highest specific growth followed by 60-16, 60-17, 45-21, 60-25, 45-20 and wild type respectively, as same as the trend of substrate consumption. Mutant 45-20 was selected for production of butanol in 10 liters of bioreactor which was designed and built for the prototype with temperature, pH, and anaerobic conditions control. The bioreactor conditions were controlled and viewed in real-time with the NETPIE cloud platform, and data was collected on Google sheets with the programming commands in Google Apps Script. The fermentation result showed that the highest butanol produced was observed at 120 hrs. with butanol concentration of 29.65 g/L, and the highest ethanol production showed at 264 hrs. with 11.30 g/L. Whereas acetone was founded low than 0.001 g/L. In the part of controlling system, it was found that the system was able to control temperature into setpoint. of 30 degrees Celsius, The pH value was adjusted only once to obtain the pH at 6.41 to 7.50 until 194 hrs. then the control system did not respond. Anaerobic control was performed manually. The data collection and feed view system by NETPIE and Google Sheets can be used effectively. However, if this research is further developed, it can be applied as a model and prototype for the development of the bio-industry in the future.

งานวิจัยนี้จัดทำขึ้นเพื่อพัฒนา Clostridium cochlearium ให้มีความสามารถในการผลิตสารบิวทานอลได้มากขึ้นและเพื่อสร้างถังปฏิกรณ์ชีวภาพที่ใช้ระบบควบคุมแบบอินเตอร์เน็ตของสรรพสิ่ง (IoT) ที่มีความจำเพาะต่อกระบวนการผลิตบิวทานอลทางชีวภาพ โดยได้นำเชื้อ C. cochlearium มาทำให้เกิดการกลายพันธุ์โดยใช้แสงยูวี ซึ่งมีระยะเวลาในการสาดแสงยูวีไปยังเชื้อเป็นระยะเวลา 0, 15, 30, 45, 60, 75 และ 90 วินาที ตามลำดับ พบว่าที่เวลาการแสงยูวี 45 และ 60 วินาที มีจำนวนโคโลนีที่สามารถอยู่รอดมากที่สุด จากนั้นทดสอบความทนต่อบิวทานอลของเชื้อกลายพันธุ์จำนวน 96 ไอโซเลท พบว่าเชื้อกลายพันธุ์สามารถเจริญเติบโตได้บนอาหารที่มีบิวทา-นอลร้อยละ 2.8 จึงได้ทำการคัดเลือกเชื้อกลายพันธุ์มาจำนวน 6 ไอโซเลท ซึ่งได้แก่ ไอโซเลทรหัส 45-20, 45-21, 60-12, 60-16, 60-17 และ 60-25 จากนั้นจึงนำเชื้อกลายพันธุ์ทั้ง 6 ไอโซเลท ไปทำการทดสอบการผลิตสารละลายอินทรีย์ได้แก่ อะซิโตน บิวทานอลและเอทานอลในขวดทดลองเทียบกับเชื้อสายพันธุ์ดั้งเดิมและวิเคราะห์ผลด้วยเครื่อง GC-MS พบว่าเชื้อที่สามารถผลิตบิวทานอลได้ความเข้มข้นสูงสุดได้แก่เชื้อกลายพันธุ์ 45-20 รองลงมาคือเชื้อกลายพันธุ์ 45-21, 60-16, 60-12, 60-17, เชื้อสายพันธุ์ดั้งเดิม และ 60-25 ตามลำดับ ซึ่งสามารถผลิตบิวทานอลได้ที่ความเข้มข้น 1.7302, 1.0263, 0.8116, 0.7233, 0.5986, 0.1085 และ 0.0081 กรัมต่อลิตร ตามลำดับ นอกจากนั้นยังพบว่าเชื้อที่สามารถผลิตเอทานอลได้ความเข้มข้นสูงสุดคือเชื้อกลายพันธุ์ 45-20 ซึ่งสามารถผลิตเอ-ทานอลได้ที่ความเข้มข้น 1.5197 กรัมต่อลิตร ส่วนเชื้อที่สามารถผลิตอะซิโตได้ความเข้มข้นสูงที่สุดคือเชื้อสายพันธุ์ดั้งเดิม ซึ่งสามารถผลิตอะซิโตนได้ความเข้มข้น 0.3852 กรัมต่อลิตร ทั้งนี้จากการศึกษาอัตราการเจริญเติบโตของเชื้อกลายพันธุ์ทั้ง 6 ไอโซเลท พบว่าเชื้อกลายพันธุ์รหัส 60-12 มีอัตราการเจริญเติบโตสูงที่สุดรองลงมาคือเชื้อกลายพันธุ์รหัส 60-16, 60-17, 45-21, 60-25, 45-20 และเชื้อสายพันธุ์ดั้งเดิม ตามลำดับ และพบว่าการใช้สารตั้งต้นก็แปรผันตรงกับอัตราการเจริญเติบโตของเชื้อ จากนั้นนำเชื้อกลายพันธุ์ 45-20 ไปทำการทดสอบการผลิตบิวทานอลในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพที่ได้ทำการออกแบบและสร้างขึ้นปริมาตร 10 ลิตร พร้อมระบบควบคุมสภาวะได้แก่ อุณหภูมิ ค่าความเป็นกรด-ด่างและสภาวะไร้ออกซิเจน มีการควบคุมและดูผลสภาวะแบบ Real-time ด้วยระบบ NETPIE มีการจัดเก็บข้อมูลสภาวะบน Google sheet ที่มีการเขียนโปรแกรมสั่งการบน Google Apps Script ผลพบว่าที่เวลาการหมักชั่วโมงที่ 120 มีการผลิตบิวทานอลได้มากที่สุดเท่ากับ 29.65 กรัมต่อลิตร และมีการผลิตเอทานอลสูงที่สุด ณ ชั่วโมงที่ 264 เท่ากับ 11.30 กรัมต่อลิตร ส่วนอะซิโตนพบว่ามีการผลิตที่ต่ำกว่า 0.0078 กรัมต่อลิตร ในการควบคุมสภาวะของระบบพบว่าระบบมีการควบคุมอุณหภูมิได้ตามเป้าหมาย คือ 30 องศาเซลเซียส ส่วนค่าความเป็นกรด-ด่างมีการปรับค่าเพียงหนึ่งครั้งโดยระดับความเป็นกรด-ด่างอยู่ในช่วงที่กำหนดคือ 6.41 ถึง 7.50 ได้ยาวถึงชั่วโมงที่ 194 การควบคุมสภาวะไร้ออกซิเจนเป็นการควบคุมด้วยตนเอง ในส่วนของระบบจัดเก็บข้อมูลและระบบรายงานผลด้วยระบบ NETPIE และ Google sheet สามารถทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตามหากมีการพัฒนางานวิจัยนี้ต่อไปในอนาคตจะสามารถนำมาประยุกต์ใช้ในการเป็นต้นแบบเพื่อพัฒนาอุตสาหกรรมชีวภาพได้เป็นอย่างดียิ่ง