Microbiological quality of sperm cryopreservation technique of stripedcatfish (Pangasianodon hypophthalmus)

Abstract

This study aimed to investigate bacterial contaminants in stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) semen loaded in 0.5-, 2.5-, and 4.0-mL straws, frozen with a simple protocol using a Styrofoam box, and cryopreserved in a liquid nitrogen tank (-196 ºC), a deep freezer (-80 ºC), and a freezer (-20 ºC) for short-term and long-term storage, and study antibiotic susceptibility of bacteria isolated from stripped catfish semen. The experimental design was divided into 4 sections. In the first experiment related to cryopreservation of stripped catfish semen in a liquid nitrogen tank for 6 days, pre-frozen semen and 30-min post-frozen semen loaded in 0.5, 2.5 and 4.0-mL straws had comparatively similar number of total heterotrophic bacteria (THB) in the ranges of 3.83±0.26 to 4.35±0.49×104 CFU/mL), which was significantly higher than those in post-frozen semen for 24 h to 6 days. In the second focused on cryopreservation of stripped catfish semen in a liquid nitrogen tank for 180 days, storage duration had no effect on THB number in the semen loaded in the three different sizes of straws and the highest THB number seemed to observe in the semen filled in 4.0-mL straw during a 180-day storage. In the third experiment in regard to comparison of bacterial change in stripped catfish semen loaded in 0.5, 2.5 and 4.0-mL straws and frozen at -20, -80 and -196 ºC for 90 days, storage temperature (F=5.72 and P=0.004) and storage duration(F=12.92 and P=0.00) were identified as the main effect on THB number in cryostored stripped catfish semen. In the last experiment pertaining to antibiotic susceptibility of 18 bacterial strains isolated from cryostored semen of stripped catfish, eight isolates (44.5%) were susceptible to all tested antibiotics including P. aeruginosa PA test, P. fluorescens PF, P. putida PPio1, P. putida PPio2, P. oryzihabitans PO, A. baumannii ABio1, A. baumannii ABio2 and A. baumannii ABio3 while seven isolates (38.9%) were resistant to at least 3 tested antibiotics. K. kristinae KO, S. maltophilia SMio1, S. maltophilia SMio2 and S. maltophilia SMio3 were classified as three multi-drug resistant (MDR3) strains whereas MDR4 strain was assigned to K. sedentarius KSio1, K. sedentarius KSio2 and K. sedentarius KSio3. This study suggests that stripped catfish semen was contaminated with MDR strains of fish pathogens and human opportunistic pathogens. Therefore, development of cryopreservation technique for stripped catfish semen to eliminate bacterial contaminants together with retaining sperm quality should be further established.

การศึกษาในครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบแบคทีเรียที่ปนเปื้อนในน้ำเชื้อปลาสวายแช่แข็งในหลอด 3 ขนาด ได้แก่ 0.5, 2.5 และ 4.0 มิลลิลิตร ที่ลดอุณหภูมิอย่างง่ายด้วยกล่องโฟมที่เก็บรักษาในถังไนโตรเจนเหลว (-196 ºC) ตู้แช่แข็ง -80 และ -20 ºC ทั้งในระยะสั้นและระยะยาว และศึกษาความไวต่อสารต้านจุลชีพของแบคทีเรียที่แยกได้จากน้ำเชื้อปลาสวาย โดยแบ่งการศึกษาออกเป็น 4 ตอน ได้แก่ ตอนที่ 1 เป็นการแช่แข็งน้ำเชื้อปลาสวายในถังไนโตรเจนเหลวนาน 6 วัน พบว่าน้ำเชื้อปลาสวายในหลอดขนาด 0.5, 2.5 และ 4.0 มิลลิลิตร ก่อนนำมาลดอุณหภูมิและน้ำเชื้อหลังแช่แข็งนาน 30 นาที มีปริมาณแบคทีเรียกลุ่มเฮทเทอโรโทรปทั้งหมดใกล้เคียงกัน (3.83±0.26 - 4.35±0.49×104 CFU/mL) ซึ่งสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P<0.05) กับน้ำเชื้อแช่แข็งตั้งแต่ 24 ชั่วโมง ถึง 6 วัน การทดลองในตอนที่ 2 ที่ศึกษาการแช่แข็งน้ำเชื้อปลาสวายในหลอด 3 ขนาด ในถังไนโตรเจนเหลวนาน 180 วัน พบว่าระยะเวลาการเก็บรักษาน้ำเชื้อในไนโตรเจนเหลวไม่มีผลต่อปริมาณแบคทีเรียกลุ่มเฮทเทอโรโทรปทั้งหมดที่ปนเปื้อนในน้ำเชื้อที่บรรจุในหลอดทั้ง 3 ขนาด โดยแบคทีเรียในน้ำเชื้อแช่แข็งที่บรรจุในหลอดขนาด 4.0 มิลลิลิตร มีปริมาณมากที่สุดตลอดระยะเวลา 180 วัน การศึกษาในตอนที่ 3 เป็นการเปรียบเทียบน้ำเชื้อปลาสวายในหลอดขนาด 0.5, 2.5 และ 4.0 มิลลิลิตร ที่แช่แข็งที่อุณหภูมิ -20, -80 และ -196 ºC นาน 90 วัน พบว่าอุณหภูมิ (F=5.72 และ P=0.004) และระยะเวลาในการเก็บน้ำเชื้อ (F=12.92 และ P=0.00) เป็นปัจจัยหลักที่มีอิทธิพลต่อปริมาณแบคทีเรียในน้ำเชื้อปลาสวายแช่แข็ง และการศึกษาในตอนสุดท้ายที่ศึกษาความไวต่อสารปฏิชีวนะของแบคทีเรียทั้ง 18 ไอโซเลท ที่แยกได้จากน้ำเชื้อปลาสวายแช่แข็ง พบว่าแบคทีเรีย 8 ไอโซเลท คิดเป็น 44.5 เปอร์เซ็นต์ ไวต่อสารปฏิชีวนะทุกชนิดที่ทดสอบ ได้แก่ P. aeruginosa PA test, P. fluorescens PF, P. putida PPio1, P. putida PPio2, P. oryzihabitans PO, A. baumannii ABio1, A. baumannii ABio2 และ A. baumannii ABio3 และแบคทีเรีย 7 ไอโซเลท คิดเป็น 38.9 เปอร์เซ็นต์ ดื้อต่อสารปฏิชีวนะอย่างน้อย 3 ชนิดที่ทดสอบ โดย K. kristinae KO, S. maltophilia SMio1, S. maltophilia SMio2 และ S. maltophilia SMio3 จัดเป็นแบคทีเรียที่ดื้อต่อสารปฏิชีวนะ 3 ขนาน ส่วน K. sedentarius KSio1, K. sedentarius KSio2 และ K. sedentarius KSio3 จัดเป็นแบคทีเรียที่ดื้อต่อสารปฏิชีวนะ 4 ขนาน การศึกษาในครั้งนี้แสดงให้เห็นว่าน้ำเชื้อปลาสวายแช่แข็งมีการปนเปื้อนด้วยแบคทีเรียก่อโรคในปลาและแบคทีเรียฉวยโอกาสในการก่อโรคในมนุษย์ที่ดื้อยาหลายขนาน ดังนั้นจึงควรมีการพัฒนาวิธีการแช่แข็งน้ำเชื้อที่สามารถกำจัดแบคทีเรียแต่ยังคงรักษาน้ำเชื้อปลาสวายแช่แข็งให้มีคุณภาพดีต่อไป